형질전환 된 Chinese hamster ovary 세포에서 Histone deacetylase inhibition을 통한 albumin-erythropoietin의 생산성과 세포사멸 확인

Title
형질전환 된 Chinese hamster ovary 세포에서 Histone deacetylase inhibition을 통한 albumin-erythropoietin의 생산성과 세포사멸 확인
Authors
김수진
Keywords
형질전환된chinesehamsterovary세포에서histonedeacetylaseinhibition을통한albuminerythropoietin의생산성과세포사멸확인
Issue Date
2011
Publisher
인하대학교
Abstract
형질전환 된 Chinse hamster ovary(CHO) 세포는 포유동물 세포를 숙주로 하는 재조합 단백질의 상업적인 생산에 있어서 가장 널리 사용되는 세포주이다. CHO 세포는 증폭 시스템으로 GS(glutamine stnthetase) 외에도 DHFR(dihydrofolate reductase) 유전자와 MTX(methotrexate)를 통해서 재조합 단백질의 높은 수준으로 발현할 수 있어 안정적이다. 또한 복잡한 단백질의 경우 요구되는 효율적인 post-translational 과정을 가지고 있고, 천연 고분자와 유사한 방식의 재조합 당단백질의 당화를 가진다. 하지만 미생물에 비하여 낮은 단백질의 수율이 문제되고 있다. 이러한 CHO 세포의 낮은 수율을 해결하기 위해 최근 들어 전체적인 생산성을 높이기 위해 시간에 따른 세포의 density와 비 생산성(specific productivity, Qp)의 증가에 따른 연구가 진행되고 있다. 다양한 전략 중 유전자의 발현 조절에 중요한 histone acetylation 기작을 들 수 있다. Histone acetyltransferase(HAT)는 histone의 N-terminus에 acetyl을 부착시키지만, histone deacetylase(HDAC)는 histone 표면의 acetyl기를 제거하는 역할을 한다. HAT에 의한 acetylation 결과 nucleosome에 응축된 histone이 풀리면서 전사 인자의 접근이 용이해지면서, 단백질을 생산할 수 있다. 하지만 HDACs가 유전자 발현을 억제함에 따라 단백질 생산이 저해된다. 따라서 CHO 세포에서 HDACi(HDAC inhibitor) 참가를 통해 비 생산성 증가에 대한 연구가 진행되고 있다. 이러한 HDACi로는 sodium butyrate, sodium propionate 그리고 valproic acid를 들 수 있다. Erythropoietin(EPO)는 세계적으로 연간 11억 달러 이상의 시장규모를 형성하고 있다. Human EPO는 3개의 N-linked와 1개의 O-linked oligosaccharide chain으로 수식된 glycoprotein으로서 asialo-EPO가 간에 있는 hepatic asialoglycoprotein receptor(ASGPR)에 잡히면 체내에서 빠르게 제거되기 때문에 sialylation이 체내의 생물학적인 활성에 중요하다. 최근, 짧은 반감기를 가지는 생물학적 활성을 가지는 peptide에 albumin 융합을 통해 체내 순환을 오래 유지할 수 있는 기술이 제안되었다. 이 기술을 이용한 albumin-EPO(Alb-EPO)는 human EPO에 human albumin을 유전적으로 융합시킨 105 kDa의 단백질로 연장된 반감기, 향상된 pharmacokinetics, 1회 투여시 요구되는 약물 감소와 같은 이점을 가지게 되었다. 본 연구에서는 Alb-EPO를 생산하는 형질전환 된 CHO 세포에 HDACi의 첨가를 통한 생산성을 확인하고자 하였다. 그 결과 HDACi 중 1 mM의 sodium butyrate의 경우 대조군에 비해 1.7배 증가된 비 생산성을 보였지만 apoptosis가 상대적으로 빠르게 진행됨을 확인할 수 있었다.
Description
1. 서론 1 1.1 생물의약품(Biopharmaceuticals) 1 1.1.1 생물의약품 1 1.1.2 동등생물의약품(Biosimilars) 2 1.2 동물세포배양 9 1.2.1 동물세포배양 9 1.2.2 CHO (Chinese Hamster Ovary) cell 10 1.2.3 재조합 단백질 발현 체계 13 1.3 재조합 단백질(Recombinant protein) 17 1.3.1 유전자 재조합 기술 17 1.3.2 EPO (Erythropoietin) 19 1.3.3 Alb-EPO (Albumin-EPO) fusion protein 20 1.4 히스톤 디아세틸화 억제 기작 (Histone deacetylase inhibition mechanism) 24 1.4.1 Epigenetics 24 1.4.2 Histone deacetyalse mechanism 24 1.4.3 HDACi (Histone deacetylase inhibitor) 25 1.5 세포 주기와 세포 사멸 28 1.5.1 세포 주기 28 1.5.2 세포 사멸 30 2. 연구 목적 33 3. 재료 및 방법 35 3.1 세포배양 및 배양 조건 35 3.1.1 세포주 35 3.1.2 세포배양 35 3.1.3 HDACi 첨가 36 3.2 분석 36 3.2.1 세포 수 및 생존도 측정 36 3.2.2 배지 내의 Alb-EPO의 정량분석 36 3.2.3 배지 내의 Alb-EPO의 정성분석 37 3.2.4 Metabolite assay 40 3.2.4 Cell cycle assay 40 3.2.5 Cell death assay : Apoptosis/Necrosis 40 4. 결과 및 고찰 42 4.1 HDACi에 의한 Alb-EPO 생산 세포의 생산성 42 4.1.1 Sodium butyrate 농도에 따른 영향 42 4.1.2 Sodium propionate 농도에 따른 영향 46 4.1.3 Valproic acid 농도에 따른 영향 49 4.2 HDACi에 의한 Alb-EPO 생산 세포의 변화 54 4.2.1 세포 주기에 따른 분석 54 4.2.2 세포 사멸에 따른 분석 56 5. 결론 59 6. 참고문헌 61
URI
http://dspace.inha.ac.kr/handle/10505/22831
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College of Natural Science(자연과학대학) > Ocean Sciences (해양과학) > Theses(해양과학 석박사 학위논문)
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