형질전환 된 벼 현탁세포를 이용한 재조합 hCTLA4Ig의 생산성 증대 연구

Title
형질전환 된 벼 현탁세포를 이용한 재조합 hCTLA4Ig의 생산성 증대 연구
Authors
유미희
Keywords
형질전환된벼현탁세포를이용한재조합hctla4ig의생산성증대연구
Issue Date
2011
Publisher
인하대학교
Abstract
생물의약품 시장이 확대됨으로써 고부가가치의 재조합 단백질의 생산에 대한 관심이 커지고 있다. 특히 식물세포 배양을 이용하여 생산한 재조합 단백질을 plant-made pharmaceuticals(PMPs)로 분류하고 있다. 동물세포나 미생물을 이용하여 단백질을 생산하는 시스템이 상업적으로 널리 이용되고 있으며 많은 연구가 이루어져 있다. 하지만 식물세포를 이용하여 단백질을 생산할 경우, 저렴한 생산비용으로 경제성이 좋고, 동물유래의 virus나 pathogen으로부터 안전하며, 동물과 유사한 post-translational modification이 가능하다는 장점을 갖고 있어서 차세대 생산 시스템으로 그 가능성을 갖고 있다. 현재 여러 PMPs가 임상던계 및 상업화 진행이 되고 있다. 식물세포 유래 고셔병 치료제인 prGCD는 임상 3상 진행 중에 있으며 상업화가 곧 이루어 질 것으로 보인다. 본 연구에서는 형질전환된 벼 세포를 이용하여 자가면역질환 치료제인 human cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4-immunoglobulin (hCTLA4Ig)을 생산하였고, RAmy3D promoter와 RAmy1A signal peptide를 사용하여 당 고갈시에 목적 단백질의 발현되어 배지로 분비 되도록 시스템을 구축하였다. 식물세포를 이용한 단백질 생산시 낮은 생산성은 가장 큰 문제점이 된다. 따라서 동물세포에서 생산성을 높이는데 효과가 있다고 다수 보고된 sodium butyrate를 첨가하여 생산성이 향상되는지 확인하고자 하였다. 1 mM의 sodium butyrate를 배지에 첨가하여 배양하였을 때 viability는 낮추지 않고 생산성은 향상됨을 확인하였다. 본 시스템은 당 고갈에 의해 목적 단백질의 생산이 유도되기 때문에 에너지원이 없는 상태에서 생산이 이루어지고, 이에 따라 세포의 viability 감소 및 세포사멸이 일어나게 된다. 또한 sodium butyrate는 일반적으로 viability를 감소시킨다고 알려져있다. 따라서 추가적으로 생산시 에너지원을 첨가해줌으로써 세포의 사멸속도를 늦추고 궁극적으로 목적 단백질의 생산성 향상을 확인하고자 하였다. 대체 에너지원인 87 mM sodium pyruvate를 첨가시 세포의 사멸속도가 늦춰지는 것을 확인하였다. Sodium pyruvate를 첨가하지 않았을 때는 6일째부터 세포가 거의 다 사멸되었지만 첨가 후에는 10일째까지 viability가 20%정도 되는 것을 확인 할 수 있었으며, 그에 따라 hCTLA4Ig의 생산량도 증가하였다. 또한 최적 농도의 sodium pyruvate와 sodium butyrate를 조합하여 첨가했을 때 가장 높은 viability와 hCTLA4Ig 생산량을 보였다. Sodium butyrate가 단백질의 생산량을 증가시키는 반면 세포의 생장을 방해하는 단점이 있는데 sodium pyruvate가 RAmy3D promoter를 억제하지 않는 추가 에너지원으로 작용하여 세포 생존도를 증진시킬 수 있었으며, 이를 통해 sodium butyrate의 에너지원으로 사용됨으로써 보완작용을 하여 viability가 증가하고 생산량도 증가한 것으로 보인다. 따라서 에너지원과 SME의 첨가로 형질전환된 벼 세포를 이용한 hCTLA4Ig의 생산성 증대를 확인하였다.
Description
1. 서론 1 1.1 생물의약품(biopharmaceuticals) 1 1.2 식물세포배양 2 1.2.1 Plant-made pharmaceuticals (PMPs) 2 1.2.2 형질전환 벼 세포 11 1.2.2.1 RAmy3D promoter 11 1.2.2.2 Human Cytotoxic T-lymphocyte antigen 4-immunoglobulin (hCTLA4Ig) 12 1.3 목적 단백질의 생산성 증대연구 13 1.3.1 Small molecule enhancers (SMEs) 13 2. 연구 목적 17 3. 재료 및 방법 18 3.1 세포배양 18 3.1.1 세포주 18 3.1.2 배양조건 18 3.1.3 세포량 측정 19 3.1.4 Cell viability 측정 21 3.2 Protease 분석 21 3.2.1 Protease 활성 측정 21 3.3 단백질 분석 22 3.3.1 총단백질 정량 22 3.3.2 hCTLA4Ig 정량분석 22 3.3.3 hCTLA4Ig 정성분석 23 3.3.4 Total Genomic DNA 분석 26 4. 결과 및 고찰 27 4.1 hCTLA4Ig 생산성 증대 연구 27 4.1.1 SMEs 첨가에 따른 단백질 생산성 증대 27 4.1.1.1 Sodium butyrate 농도에 따른 영향 27 4.1.2 에너지원 첨가에 따른 단백질 생산성 증대 32 4.1.2.1 에너지원 첨가에 따른 영향 32 4.1.3 Sodium butyrate와 sodium pyruvate 첨가 조합 실험 37 5. 결론 44 6. 참고문헌 46
URI
http://dspace.inha.ac.kr/handle/10505/22829
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College of Natural Science(자연과학대학) > Ocean Sciences (해양과학) > Theses(해양과학 석박사 학위논문)
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