면역억제제 타크로리무스의 분리 정제 및 유도체 동정에 관한 연구

Title
면역억제제 타크로리무스의 분리 정제 및 유도체 동정에 관한 연구
Authors
함윤범
Keywords
면역억제제타크로리무스의분리정제및유도체동정에관한연구
Issue Date
2011
Publisher
인하대학교
Abstract
본 연구는 tacrolimus를 고수율로 생산할 수 있는 돌연변이 균주 스트렙토마이세스 클라불리저러스 (Streptomyces clavuligerus sp.) CKD 1119 (수탁번호 : KCTC 10561BP) 의 제조 방법과 고순도 tacrolimus 정제 방법 및 그 유연물질의 구조 규명을 포함한 미확인 물질의 분리 동정에 관한 것이다. Tacrolimus 고생산변이주를 이용한 flask 및 fermenter 실험을 통하여 식균량, 점도, pH, 균체량 및 기질 농도 control 등의 중요한 parameters 에 대한 조건을 최적화함으로써, tacrolimus 생산성을 향상시키고, 함량을 개선시킬 수 있는 발효 기술을 확립하였다. 균주 개량에 있어서는 malonic acid와 최종 product인 tacrolimus에 대한 feedback inhibition이 최소화된 균주를 선별함으로써, 초기 274 mg/L의 생산성을 보였던 모균주로부터, 생산성이 502 mg/L로 약 80% 가량 향상된 변이주를 획득하였다. 정제공정의 최적화는 각 단위 공정별 주요 parameter를 적용하여 추출, 농축, 크로마토그래피, 결정화 등의 분리 공정을 표준화시키고자 하였고, 유연물질의 생성여부 및 최소화 조건을 검토하여 안정적인 산업화 공정을 수행할 수 있는 기초연구를 수행함으로써 발효생산성과 더불어 효율적인 정제공정을 확립하고자 하였다. 또한 선행기술의 공정 복잡성에 의한 비경제인 요소를 극복하기 위해, 소수성 흡착수지공정을 포함한 예비정제 단계와 조분말의 결정화를 통해 고순도 tacrolimus를 제조하는 방법을 확인하였다. Streptomyces clavuligerus CKD 1119의 변이주가 생산하는 발효액으로부터 tacrolimus를 회수하는 정제 공정 중 고순도 tacrolimus 확보를 위한 유도체 분리 방법에 관한 연구와 기기분석을 통한 물질동정 연구를 수행하였다. 또한 발효액으로부터 tacrolimus를 회수하는 추출방법을 기존 추출법과 비교 검토한 후, 고순도 tacrolimus 회수를 위한 정제 공정 최적화 연구를 수행하여 선행 기술로 분리 회수한 tacrolimus의 품질이 자가규격에 적합함을 확인하였다. 그 결과, tacrolimus의 회수율은 35%, 설정된 자가 기준에 의한 순도는 99.5 %를 나타내었으며 유연물질로서 tacrolimus의 수분 영향에 민감한 호변체 tautomer Ⅰ, Ⅱ 물질과 tacrolimus와 구조적으로 유사하여 분리하기 어려운 ascomycin, dihydrotacrolimus, 그리고 선행기술에 공지되어 있지 않은 미확인 물질 (unknown derivative)을 HPLC, NMR, Mass 등의 기기분석을 통하여 분리 동정함으로써 유연물질의 함량을 최소화할 수 있는 정제공정을 확립하였고, 분리 회수가 완료된 각 유연물질들은 LC-MS/MS, 1H-NMR 및 13C-NMR 기기 분석과 선행 공지기술에 기재된 정보로부터 구조를 규명하고 각 유연물질의 구조가 일치됨을 검증하였다. Unknown derivative는 LC-MS/MS 기법을 통해 분자량이 818 m/z로 분석되었고, ascomycin과 tacrolimus의 allyl group의 구조적 차이로부터 carbon number에 따른 13C-NMR 분석을 통해 비교하여 구조해석을 수행한 결과, 공지되지 않은 신규의 18-methyltacrolimus 물질로 규명하였다.
Description
목차 ⅰ 그림 목차 ⅳ 표 목차 ⅶ 약기호표 viii 국문 요약 ⅹ 영문 요약 xii 제 1장 서론 1 제 2장 실험재료 및 방법 22 2.1. 균주 22 2.2. 균주 배양방법 22 2.3. 정제공정 및 물질동정 23 제 3장 실험결과 31 3.1. 균주 개량 31 3.1.1 Streptomyces clavuligerus CKD 1119 특성 31 3.1.2. Tacrolimus 내성 adaptation 통한 생산성 회복 37 3.1.3. Malonate 내성주 선별을 통한 균주개량 37 3.1.4. Tacrolimus 내성 mutants 선별조건 보완 39 3.2. 배양조건 최적화 41 3.2.1. 식균량 검토 41 3.2.2. Tapioca starch 적용 가능성 검토 41 3.2.3. NaH2PO4 농도가 tacrolimus 발효에 미치는 영향 42 3.2.4. Scale-up 적용 42 3.3. 정제공정 48 3.3.1. 배양액 여과 및 추출 조건 확립 48 3.3.2. Normal phase silica gel에 의한 정제 51 3.3.3. Reverse phase silica gel에 의한 정제 51 3.3.4. 결정화 56 3.3.5. 품질 검토 56 3.4. 물질동정 63 3.4.1. IR absorption spectrum 63 3.4.2. NMR spectrum 62 3.4.3. Mass spectrum 71 3.5. 유도체 분리회수 73 3.5.1. HPLC 분석 방법에 의한 분리 74 3.5.2. Tautomer Ⅰ, Ⅱ(호변체) 77 3.5.3. Ascomycin 77 3.5.4. Dihydrotacrolimus 78 3.5.5. 강산성 수지에 의한 ascomycin 분리 82 3.5.6. 순상 silica gel resin에 의한 ascomycin 분리 82 3.5.7. Prep-HPLC를 이용한 tautomer Ⅱ의 분리 84 3.5.8. Silica gel resin에 의한 unknown derivative의 분리 84 3.6 Scale up 정제공정 86 3.6.1. 추출 공정 88 3.6.2. 여과 공정 89 3.6.3. 흡착수지 공정 89 3.6.4. 색소 제거 공정 89 3.6.5. Amberchrom CG 161M 공정 90 3.6.6. 유도체 정제 공정 92 3.7. 유도체 동정 97 3.7.1. 유도체 구조 해석 97 3.7.2 Unknown derivative 의 구조 분석 112 3.7.3. Tacrolimus 와 ascomycin의 NMR 분석 116 3.7.4. Unknown derivative의 구조해석 117 제 4장 고찰 132 제 5장 결론 140 참고 문헌 142 부록 156
URI
http://dspace.inha.ac.kr/handle/10505/22531
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College of Engineering(공과대학) > Biotechnology (생명공학) > Theses(생명공학 석박사 학위논문)
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